Diferencias entre mitosis y meiosis.

Interfase.

En este dibujo encontramos la explicación de hoy sobre la interfase. El tamaño del dibujo en cada fase va relacionado con el tiempo de duración para el paso de una fase a otra (aproximadamente). 

Ánimo a todos con la tarde de estudio. 

PRÁCTICA EXTRACCIÓN DE ADN.

Extracción de ácidos nucléicos La extracción de los ácidos nucléicos (ADN y ARN) es el primer paso para poder utilizar un marcador molecular. Cada persona realizará 2 extracciones, siguiendo los siguientes pasos:

a) Introducir una hojita pequeña de tomate en cada tubo. Si es demasiado grande se coge un trozo. De esta hoja se realizará la extracción de ADN.

b) Añadir 250 µl de tampón de extracción (Tris 100 mM pH 8, EDTA 50 mM pH 8 y NaCl 500 mM).

c) Triturar con un “palito azul” hasta que no queden restos de hoja. Este palito es el instrumento con el que se titulará la hoja.

d) Añadir 250 µl de tampón de extracción. Mezclar con el palito poco a poco para poder comprobar el resultado.

e) Añadir 35 µl de SDS. Agitar suavemente para no formar demasiada espuma. Con el objetivo de que no coja demasiado aire.

f) Incubar los tubos a 65 ºC durante 5 minutos. En este tiempo las reacciones se irán formando.

g) Añadir 130 µl de acetato de potasio 5 M. Más reacciones.

h) Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.Con esto se ordenan los componentes de la reacción y se separan de ,la mezcla..

i) Centrifugar los tubos a 13.000 rpm durante 10 minutos.

j) Pasar el sobrenadante (500 µl) a otro tubo limpio, rotulado convenientemente. Procurar no arrastrar restos. Con el objetivo de quedarnos solo con lo que nos interesa.

k) Añadir 500 µl de isopropanol y 60 µl de acetato de sodio 3 M. Dos compuestos orgánicos.

l) Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

m) Centrifugar los tubos a 13.000 rpm durante 10 minutos. Para que se ordenen los componentes de la reacción y se separen de la mezcla.

n) Eliminar la mayor cantidad posible del líquido sobrenadante, sin arrastrar el precipitado. El resto se evapora.

o) Añadir 300 µl de etanol al 70 %. Golpear el tubo para que el precipitado se desprenda del fondo.

p) Centrifugar los tubos a 13.000 rpm durante 5 minutos.

q) Eliminar la mayor cantidad posible de alcohol. Si queda, dejar los tubos abiertos para que se evapore.

r) Una vez que esté completamente seco se resuspende, añadiendo una pequeña cantidad de agua estéril (30 a 100 µl).

Se conserva en la nevera a 4 ºC durante meses. En la nevera y a esta temperatura para evitar microbios.

Para comprobar la calidad de la extracción se puede realizar una electroforesis, junto con extracciones ya comprobadas. Este proceso se basa en la separación de moléculas según su movilidad en el campo eléctrico.  

Electroforesis en geles de agarosa ->El método de separación de moléculas de ADN de uso más frecuente es la electroforesis en geles de agarosa (un polisacárido cuyas propiedades son similares a las del agar) teñidos con bromuro de etidio. El bromuro de etidio es un agente intercalante, que emite fluorescencia cuando es expuesto a la luz ultravioleta (312 nm), lo que posibilita la visualización de las moléculas de ADN en el gel. Se utilizará como electrolito TAE 1x (Tris-Acetato-EDTA). Deberá tenerse especial cuidado en el manejo del bromuro de etidio, un poderoso mutágeno, por lo que se debe manipular el gel con sumo cuidado y empleando guantes en todo momento. Utilización de guantes y bata.

Preparación de un gel de agarosa-> Para evitar que los alumnos manipulen bromuro de etidio, los geles de agarosa se preparan antes de empezar la práctica. La preparación de un gel de agarosa en TAE 1x comprende las siguientes etapas:

a) Tomar el volumen necesario del tampón de electroforesis y verterlo en un matraz de volumen adecuado. Sin pasarnos de la cantidad ya que esto puede provocar un error en todo el proceso.

b) Pesar la correspondiente cantidad de agarosa y depositarla en el matraz.

c) Disolver la agarosa mediante calentamiento en un microondas. Debe interrumpirse el calentamiento siempre que la disolución entre en ebullición. Comprobar que la agarosa se ha disuelto completamente en el tampón y que no se han formado burbujas y dejar enfriar.

d) Mientras tanto, sellar el portageles con cinta adhesiva y colocar el peine sobre el portageles. Después verteremos la muestra.

e) Añadir bromuro de etidio a la disolución de agarosa, hasta una concentración final de 0,5 µg/ml (la disolución madre se encuentra a 10 µg/µI).

f) Agitar suavemente la disolución y verterla en el portageles, donde polimerizará al enfriarse. g) Una vez que se observe que la agarosa ha solidificado retirar el peine y la cinta adhesiva. Si no va a utilizarse inmediatamente, el gel puede conservarse a 4°C en el frigorífico, envolviéndolo con una lámina de plástico transparente, para evitar su deshidratación.

Electroforesis-> Cargar las muestras correspondientes y el marcador de peso molecular en los pocillos del gel. Conectar los electrodos a la fuente de alimentación, colocando el de color rojo en el extremo opuesto a aquél en el que se cargó el ADN. Poner en marcha la fuente de alimentación, regulándola a un voltaje constante y dejar transcurrir la electroforesis el tiempo necesario. El ADN, cargado negativamente, migra hacia el polo positivo del campo eléctrico generado por la fuente de alimentación, con una velocidad que depende de varios parámetros: el tamaño y la conformación de la molécula, la concentración de agarosa en el gel y el voltaje aplicado. Una vez terminada la electroforesis se visualizará el gel. Para ello se colocará el gel en el transiluminador UV, y con las protecciones oportunas se hará una foto al gel. Ejemplo de electroforesis en gel de agarosa de extracciones de ADN Pocillos Impurezas ADN ARN ARN degradado

Esta práctica la realizaremos el jueves día 11, mientras tanto seguiremos trabajando y subiendo trabajos al blog.

¡ÁNIMO!

Actividad calculo rendimiento.